引言
結(jié)合疫苗，尤其是針對(duì)2歲以下兒童的疫苗，通過(guò)將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，可以提高免疫原性。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，利用白喉減毒毒素(CRM197蛋白)作為載體蛋白而制成的結(jié)合疫苗，會(huì)存在游離蛋白，影響藥物品質(zhì)，且通過(guò)傳統(tǒng)方式難以精確檢出，具有較高的安全隱患。
艾美衛(wèi)信生物藥業(yè)(浙江)有限公司開(kāi)發(fā)的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定方法，采用了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱，配合特定的色譜條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)游離CRM197蛋白含量的精確測(cè)定。與競(jìng)品色譜柱相比，SRT SEC-300色譜柱具有更高的分離度和信噪比，能夠更有效地將CRM197蛋白從結(jié)合物中分離出來(lái)，顯著提升了檢測(cè)的靈敏度和精確度。此外，該方法優(yōu)化了柱溫和pH值，確保了方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性(專(zhuān)利號(hào)CN110018253A，點(diǎn)擊文末閱讀原文查詢文章)。
背景介紹
多糖疫苗抗原(CPS)屬于胸腺非依賴(lài)性抗原(TI-Ag)，無(wú)法充分激發(fā)兒童的免疫系統(tǒng)。通過(guò)將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，制成結(jié)合疫苗，可以將TI-Ag轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵僖蕾?lài)性抗原(TD-Ag)，從而增強(qiáng)免疫原性，為兒童提供長(zhǎng)期保護(hù)。然而，在制備結(jié)合疫苗的過(guò)程中，游離蛋白可能會(huì)影響疫苗的免疫效果，甚至引發(fā)不良反應(yīng)。因此，精確檢測(cè)其含量變得尤為關(guān)鍵。
目前，檢測(cè)結(jié)合疫苗中游離蛋白含量的方法主要是《中國(guó)藥典》記載的HPLC法。方法的建立，也受到載體蛋白的性質(zhì)、檢測(cè)分析柱的選型等各方面的影響。本專(zhuān)利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)合疫苗中游離CRM197蛋白含量的精確測(cè)定，保證了精確度與重復(fù)性，降低了檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了操作流程，有望成為結(jié)合疫苗質(zhì)量控制中的重要工具，為疫苗的安全性和有效性提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。
文章概述
在疫苗研究領(lǐng)域，精準(zhǔn)測(cè)定游離蛋白含量對(duì)于確保疫苗的安全性和有效性至關(guān)重要。本專(zhuān)利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，通過(guò)優(yōu)化條件，能夠精確測(cè)定出結(jié)合疫苗中的游離蛋白含量；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)可以將CRM197蛋白的檢測(cè)限確定在0.15625μg，定量限約為0.625μg，反映了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱在低濃度樣品中的高靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠減少待測(cè)樣品的用量，從而降低游離蛋白的檢測(cè)成本。該方法在疫苗研發(fā)、藥物篩選評(píng)估等方面具有重大意義。
精確度考察
本專(zhuān)利以腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗、肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗作為測(cè)定樣品，依次命名為結(jié)合物a、結(jié)合物b、結(jié)合物c。將樣品用0.2M氯化鈉稀釋樣品至蛋白濃度為200μg/mL，各取1mL，分別加入0wt%、1wt%、3wt%、5wt%的CRM197蛋白。以加樣回收率來(lái)考察精確度，每個(gè)樣品檢測(cè)3次進(jìn)行重復(fù)性判定。
色譜柱：SRT SEC-300(7.8×300mm,5μm,300Å)
流動(dòng)相：0.2M NaCl(pH7.2±0.02)
柱溫：23±1℃
流速：0.5mL/min
紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：UV280nm
固定進(jìn)樣體積：100μL
結(jié)果如下：
圖1.結(jié)合物a+CRM197蛋白
圖2.結(jié)合物b+CRM197蛋白
圖3.結(jié)合物c+CRM197蛋白
圖1-圖3是向三種結(jié)合物加入不同濃度CRM197蛋白的檢測(cè)結(jié)果。由圖可知，在設(shè)定的試驗(yàn)參數(shù)和條件下，SRT SEC-300色譜柱分離度較好(＞1.70)，可重復(fù)性高。且進(jìn)一步計(jì)算發(fā)現(xiàn)，回收率皆處于80-120%之間，CV%皆小于5%，滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，表示本檢測(cè)方法準(zhǔn)確可信。
表1.不同濃度CRM197蛋白的信噪比
表1是向三種結(jié)合物加入不同濃度CRM197蛋白所測(cè)得的信噪比。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，可以確定有無(wú)CRM197蛋白的檢測(cè)限約在0.15625μg，再結(jié)合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中信噪比＞10.0的規(guī)定，可以確定CRM197蛋白含量的定量限在0.625μg左右。
根據(jù)定量限的數(shù)值，大致可以確定進(jìn)樣樣品中總蛋白含量最小應(yīng)在12.5μg以上為佳。本專(zhuān)利中，進(jìn)樣樣品中總蛋白含量在20-50μg，可有效降低樣品的使用量，具有檢測(cè)結(jié)果精確、檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
綜上所述，SRT SEC-300色譜柱，展現(xiàn)出了快速、高效的分離性能，能夠在確保高分離度的同時(shí)，維持良好的信噪比，在特定的柱溫和pH條件下，能夠滿足對(duì)游離蛋白含量精確測(cè)定的高標(biāo)準(zhǔn)要求，這對(duì)于保證結(jié)合疫苗的安全性和有效性至關(guān)重要。
產(chǎn)品介紹
賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術(shù)，分離速度快，分辨率高，通用性好，批次重現(xiàn)性強(qiáng)，適用于質(zhì)控QC放行，也是分析型SEC值得信賴(lài)的產(chǎn)品。
圖2.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產(chǎn)品，采用賽分科技獨(dú)有的固定相修飾工藝（見(jiàn)圖2），硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。“-C”系列產(chǎn)品適用于疏水性較強(qiáng)的樣品，可以減少有機(jī)相的使用，安全、環(huán)保，讓您的實(shí)驗(yàn)無(wú)后顧之憂。
延展閱讀
體積排阻色譜法適用于從小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室研究到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的廣泛需求。賽分科技SEC系列產(chǎn)品具有柱容量大、操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化的特點(diǎn)，能夠穩(wěn)定、連續(xù)地處理大量樣品，滿足治療性蛋白在疫苗研制、臨床試驗(yàn)?zāi)酥辽虡I(yè)化生產(chǎn)中的高通量需求。
鏈接：點(diǎn)擊以下文章再次閱讀，了解SEC操作指南，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
《SEC方法流動(dòng)相配制指南》
《色譜柱保養(yǎng)小貼士：SEC/IEX色譜柱清潔指南》
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