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寡核苷酸藥物純化解決方案

發(fā)布時(shí)間:2024-08-28瀏覽次數(shù): 賽分新聞

  寡核苷酸(Oligonucleotides)是短鏈核苷酸總稱,是繼小分子類藥物和抗體藥物后的再一次研發(fā)浪潮,也是近幾年研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。寡核苷酸藥物也稱小核酸藥物,包括反義寡核苷酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酸適配體(Aptamer)等。目前,全球已有19款寡核苷酸藥物獲批上市(3款已退市),在市的共有9款A(yù)SO藥物、6款siRNA藥物和1款核酸適配體。寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強(qiáng)、高效性和長(zhǎng)效性等明顯性優(yōu)勢(shì),成為近年來(lái)全球資本和藥企爭(zhēng)相布局的新賽道。

表1. 2024年已上市小核酸藥物梳理

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背景簡(jiǎn)介

  寡核苷酸化學(xué)合成方面包括核苷酸單體合成、遞送系統(tǒng)合成和寡核苷酸偶聯(lián)物合成等,修飾包括核糖、堿基、骨架和遞送系統(tǒng)的修飾。堿基合成一般分4步:脫保護(hù)(Deprotection, DET)、縮合連接(Coupling, CPL)、加帽反應(yīng)(Capping,CAP)和氧化穩(wěn)定(Oxidation, OXI),寡核苷酸合成一般需重復(fù)上述步驟添加核苷酸殘基以產(chǎn)生特定序列。合成過(guò)程伴隨雜質(zhì)產(chǎn)生,如圖1結(jié)構(gòu),寡聚體缺失核苷(“N-1雜質(zhì)”)或具有磷酸二酯鍵而不是所需的硫代磷酸酯鍵(“P=O 雜質(zhì)”),在合成期間或之后暴露在氧化條件中將 P=S 鍵轉(zhuǎn)化為 P=O 鍵以形成 P=O 雜質(zhì)。這些雜質(zhì)的分離和去除對(duì)下游工藝開(kāi)發(fā)、填料的選擇提出了一定的要求。

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圖1. 寡核苷酸及其類似物結(jié)構(gòu)示意圖

純化方案

  根據(jù)寡核苷酸藥物典型生產(chǎn)工藝(如圖2),寡核苷酸下游工藝的常見(jiàn)N-X、N+Y、修飾副產(chǎn)物、脫嘌呤成分等雜質(zhì)(如表2),常用陰離子層析、反相層析、疏水層析等方法去除。陰離子層析通用性強(qiáng)、成本低且分辨率高,通常為寡核苷酸純化的第一選擇,隨核苷酸鏈長(zhǎng)逐漸增加,相關(guān)雜質(zhì)的去除難度越大,在陰離子無(wú)法滿足需求的情況下,可選擇保留端基DMT方式,采用反相模式純化。賽分科技推薦Proteomix POR15/30-MQ和Bio-C18填料,主要適用于siRNA藥物和純化難度較高的寡核苷酸藥物生產(chǎn)純化,滿足高載量、高純度以及高回收率的需求。

表2. 寡核苷酸制備雜質(zhì)及層析方法

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圖2. 寡核苷酸藥物制備工藝示意圖

  01陰離子交換層析

  Proteomix POR MQ填料均為親水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)微球,填料表面經(jīng)賽分科技特殊親水涂層處理,具有更好的親水性,最大程度地避免了與生物類樣品的非特異性吸附。Proteomix POR MQ填料分為15 μm與30 μm兩種粒徑,小粒徑填料具有更高的分辨率及載量;填料配基為混合模式陰離子交換基團(tuán),能夠提高對(duì)N-1、N-2雜質(zhì)的分離度,對(duì)長(zhǎng)鏈(超過(guò)50nt)或疏水性較強(qiáng)(DMT on)的寡聚核苷酸分子的純化尤其推薦。若MQ結(jié)合力過(guò)強(qiáng),且非防爆車間無(wú)法使用有機(jī)溶劑情況下,推薦選擇Proteomix POR15/30-Q,且Proteomix POR15/30-Q可用于柱上脫DMT保護(hù)等操作。

表3. 陰離子交換層析填料技術(shù)參數(shù)

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應(yīng)用案例一

  Proteomix POR30-MQ純化某siRNA樣品,樣品長(zhǎng)度: 21 nt,關(guān)鍵去除雜質(zhì):N-1、N-2、P=O、脫嘌呤雜質(zhì)等,上樣載量為10 mg/mL,純化圖譜見(jiàn)圖3。樣品純度純化前為81.2%,純化后為94.96%,回收率74%,競(jìng)品填料純度為95.04%,回收率為43.75%,兩款填料純度保持一致,Proteomix POR30-MQ回收率明顯高于競(jìng)品填料。

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圖3. siRNA樣品純化及UPLC分析圖譜

應(yīng)用案例二

  Proteomix POR30-MQ純化某ASO樣品,關(guān)鍵去除雜質(zhì):N-1、N-2、P=O雜質(zhì)等,上樣載量5 mg/mL,純化圖譜見(jiàn)圖4。樣品純度純化前為80.73%,經(jīng)Proteomix POR30-MQ純化后為95.00%,競(jìng)品填料純化后純度為91.92%,Proteomix POR30-MQ純化性能更佳。

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圖4. ASO樣品純化及HPLC分析圖譜

  02反相層析

  完全脫保護(hù) (DMT-off) 的寡核苷酸可以通過(guò)陰離子交換層析 (IEX) 進(jìn)行純化。部分樣品結(jié)構(gòu)性質(zhì)特殊,下游層析難度大,可保留DMT端基,采用反相純化后脫保護(hù),再采用陰離子精純的方法。反相層析具備高分辨率優(yōu)勢(shì),在填料選擇上,以高分辨率硅膠反相填料為主,賽分科技推薦C18填料,高載量,高選擇性和分離效率,使純化后的樣品純度及N-X、P=O等關(guān)鍵性指標(biāo)的控制上滿足要求。Bio-C18應(yīng)用于某寡核苷酸樣品純化,純化后達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。BR-C18孔徑較小,對(duì)于分子量偏小的樣品載量更高。表4為C18填料的技術(shù)參數(shù),文末可填寫問(wèn)卷信息申請(qǐng)?jiān)囉谩?/p>

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表4. C18填料的技術(shù)參數(shù)

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訂購(gòu)信息

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  *參考文獻(xiàn):Klabenkova K, Fokina A, Stetsenko D. Chemistry of Peptide-Oligonucleotide Conjugates: A Review. Molecules. 2021 Sep 6;26(17):5420. doi: 10.3390/molecules26175420. 

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