引言

　　日常的液相實驗操作中，流動相配制是實驗技術人員需要掌握的基礎。流動相的選擇和配制不僅影響樣品的溶解度和分離效果，還直接關系到色譜柱的壽命和儀器的使用性能。因此，掌握流動相的配制技巧對于獲得準確的色譜分析結果至關重要。

　　本期我們以體積排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography，SEC）為例，與大家分享一些流動相配制方面的技巧小貼士，幫助大家獲得穩(wěn)定可靠的分析結果。

　　流動相選擇

　　生物大分子的SEC方法，最常用的流動相是磷酸緩沖鹽。通常情況下，SEC的分離效果不受流動相的影響。若峰形受到靜電吸附作用及疏水作用的影響，造成拖尾或出峰異常等現象，則可以在流動相中加入高鹽或有機試劑來進行改善。常用的有機試劑包括：異丙醇、乙腈等。

　　選擇要點

　　1.樣品在選用的流動相中有較好的溶解性和穩(wěn)定性；

　　2.流動相需在色譜柱的耐受范圍內使用，包括流動相的pH、有機相比例等。通常硅膠基質的SEC色譜柱，耐受流動相的pH范圍為2.0~8.0，如需在緩沖鹽中加入有機試劑，有機試劑的添加比例需控制在20%以內。

　　配制步驟

　　1.150mM PB緩沖鹽：

　　稱取Na?HPO?·12H?O 62.01g和NaH?PO?·2H?O 19.795g置于2L燒杯中，加入2000mL超純水。用磷酸或氫氧化鈉溶液微調至pH7.0，抽濾。

　　2.150mM PB緩沖鹽+5%異丙醇（體積比）：

　　按上述方法配制150mM PB緩沖鹽（pH7.0）950mL，加入50mL異丙醇，超聲15min?；旌暇鶆?，現配現用。

　　3.20mM PB緩沖鹽+250mM NaCl：

　　稱取NaH?PO?·2H?O 1.59g和Na?HPO?·12H?O 3.51g以及NaCl 14.61g ，加入1000mL超純水，微調至pH7.0，抽濾 。

　　4.如需其他pH磷酸鹽緩沖液，可以參考以下配比表，根據實際需求進行配制。

表1.不同pH的磷酸鹽緩沖液配制表

*A液：0.2M NaH?PO?水溶液；B液：0.2M Na?HPO?水溶液

　　注意事項

　　1.當系統(tǒng)內原為緩沖鹽溶液需替換為高有機相比例（純）溶劑或系統(tǒng)內原為高有機相比例（純）溶劑需替換為緩沖鹽溶液時，必須先用純水或低有機相比例溶劑（如小于20%有機相）過渡。過渡時，通常設定流速為實驗流速的一半，沖洗2倍柱體積。

　　2.流動相最好現配現用：乙腈揮發(fā)快，易導致有機相比例變化；磷酸鹽緩沖液易長霉長菌。

　　3.流動相一般貯存在玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能用塑料容器貯存。

　　4 緩沖鹽流動相連續(xù)使用一般不超過兩天。

　　實驗要領

　　1.過濾和脫氣：

　　將配制好的無機鹽緩沖液通過0.45μm或更小孔徑水系濾膜進行過濾，以去除其中的不溶性顆粒。同時，使用超聲波或真空脫氣機對流動相進行脫氣，以消除其中的氣泡，確保色譜分析的穩(wěn)定性和準確性。

　　2.調整pH：

　　合適的pH值有助于改善樣品的溶解性和分離效果。通常SEC色譜柱流動相需要保持在pH7.0中。

　　3.色譜柱保存：

　　若長期不用時，SEC色譜柱建議保存在含0.02%NaN3的150mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）或20%乙醇中，以防止菌體污染。

產品介紹

　　在建立SEC方法時，需根據樣品分子量大小、尺寸大小等信息，選擇合適孔徑的色譜柱，此外要根據分離目的，選擇合適的粒徑和填料工藝。賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術，分離速度快，分辨率高，是分析型SEC值得信賴的產品。

圖1.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝

　　“-C”系列產品，采用賽分科技獨有的固定相修飾工藝，硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。適用于疏水性較強的樣品，可以減少有機相的使用，“-C”系列產品安全、環(huán)保，讓您的實驗無后顧之憂。

　　賽分科技SEC系列色譜柱，分離范圍廣，適用于多種細分領域，下表是部分產品的分離范圍。

表2.賽分科技SEC色譜柱分離范圍